左非洲，右亚洲

来自灭绝的印度猎豹的远古线粒体DNA支持了与非洲猎豹出人意料的深刻分歧（2020）


印度猎豹在20世纪中叶被猎杀至灭绝。虽然对139bp线粒体DNA（mtDNA）的分析已经证实印度猎豹是亚洲亚种（Acinonyx jubatus venticus）的一部分，但由于基因数据有限，印度猎豹种群之间的详细关系仍不清楚。我们通过研究印度猎豹博物馆标本和两头非洲猎豹mtDNA的对比，阐明了这些关系，它们分别来自印度猎豹博物馆的标本和两只非洲猎豹，一种是现代的，一种是历史的，在不同时期进口到印度的。我们的研究结果表明，猎豹mtDNA最新的共同祖先大约是目前所认识的两倍。印度和东南非洲（Acinonyx jubatus jubatus）猎豹mtDNA分歧约7.2万年（ 72kya），而东南非洲和东北非洲（Acinonyx jubatus soemmeringii）猎豹mtDNA分歧约13.9万年（139 kya）。此外，从印度采集的历史悠久的非洲猎豹被证明具有A.j.jubatus单倍型，这表明19世纪南非猎豹进入印度的路线迄今尚未被承认。总之，我们的研究结果对印度豹亚种之间的关系有了更深入的了解，并对a.j.venticus的保护和印度猎豹的重新引入具有重要意义。

1947年，最后三只印度猎豹（亚洲猎豹亚种，Acinonyx jubatus venticus）被科尔瓦伊州的马哈拉贾射杀。尽管猎豹很可能在隔离的地方存活了一段时间，但这起事件是人类对次要物种进行破坏性干预的悠久历史中的最后一次行动。在莫卧儿王朝时代，猎豹被大量追捕。据说莫卧儿皇帝阿克巴（1556-1605）一生拥有9000只猎豹。他的联盟最高峰时有1000只动物，而且只有一个圈养繁殖记录，几乎所有这些动物都是野生的。在英国统治期间，印度的大型猫科动物继续受到人为的压力，例如，估计有超过80000多只老虎被杀。这一时期猎豹的报道相对较少，部分原因是猎豹已经很少。印度猎豹所属的亚种亚洲猎豹（Acinonyx jubatus venticus）的最后一个保护的种群现在生活在伊朗，并且它们处于一个不稳定的保护环境中。最近，在了解非洲猎豹亚种之间的基因组关系方面取得了重大进展。最新研究为猎豹进化史提供了重要的系统地理背景，并可为保护决策提供依据。两个密切相关的非洲亚种的全基因组数据表明，它们的共同祖先在13.1万年左右经历了一次大规模的扩张，随后在2.4万年又被分成两个亚群，最近又从1.2万年开始出现区域隔离和瓶颈。虽然13.1万年的扩张被解释为现代猎豹从假定的美洲来源种群中扩散的证据，但基因证据表明，“美洲猎豹”与美洲狮的关系更为密切，因此，现代猎豹很可能起源于旧大陆，而这种早期扩张可能会重新分散在欧亚大陆或非洲。由于缺乏来自其他猎豹种群的可比基因组数据，目前尚不清楚该模型是否适用于包括濒危亚洲猎豹在内的所有猎豹亚种的精确性，该模型是一个来自约2.4万年的共同祖先，随后又被隔离，种群数量急剧下降。

亚洲猎豹的数据数量有限——现代伊朗样本和历史博物馆标本中的少量线粒体DNA片段（包括印度猎豹的139 bp），加上来自伊朗样本的lim-ited常染色体微卫星数据，导致非洲和亚洲猎豹之间的差异更大，约为3.2-6.7千年。也许令人惊讶的是，亚洲猎豹与东南部非洲猎豹的线粒体关系可能比东北部非洲猎豹更为密切。在基因组模型的背景下解释这些结果表明，区域种群差异是晚更新世的一系列事件，包括非洲和亚洲之间潜在的复杂扩散。然而，其他作者使用更大的mtDNA片段进行的分析并没有复制出亚洲猎豹和东南非洲猎豹之间更紧密的联系，并且认为最近的差异出现在4.5–6.5千年，这是非洲猎豹在过去1.2 万年期间持续瓶颈的开始。因此，我们可以强调两个系统地理学的争论——现代猎豹的起源，很可能被认为是旧世界，以及区域孤立的时间尺度，包括非洲和亚洲猎豹之间的差异。后一个问题尤其重要，因为目前关于通过进口非洲动物在印度重建野生猎豹种群的可能性的讨论。在本研究中，我们试图解决猎豹亚种之间的关系，并解决更古老和更现代之间的差异，亚洲和非洲猎豹的日期差异，测试了以前的年代被有限的遗传数据所阻碍的程度。为此，我们报告并分析了从一个新的历史上的印度a.j.venticus样本（Ind1）中回收的线粒体dna数据，该样本由一个更大的线粒体基因组4116bp片段组成。此外，我们还包括两个样本，以便更准确地确定年代，两个样本都是在不同时期进口到印度的，都是非洲血统（Ind2和Ind3，见方法）。其中一个提供了东北非洲猎豹（a.j.soemmeringii）的第一个完整mtDNA，而第二个是另一个历史上东南非洲猎豹样本的部分mtDNA。通过结合这些数据源，我们能够精确地确定非洲和亚洲亚种的母系关系和分歧。我们的研究结果强调了亚洲猎豹的独特性，以及动物保护的重要性。

印度最近的猎豹史很不幸。它的灭绝很可能发生在1960年，标志着人类活动和干预导致的长期衰退的结束。越来越多的草原改作农业用地给人口带来了巨大的栖息地压力，而自16世纪以来，由于印度宫廷的大规模放牧，导致这些猎豹种群进一步枯竭。随着猎豹在18世纪和19世纪变得越来越稀有，这项运动的受欢迎程度下降，英国时代的战利品狩猎和猎豹被杀的悬赏进一步促成了猎豹的衰落。据了解，在1800年至1950年期间，至少有127只猎豹被捕获、杀害或拍照，记录证明，1870年至1925年间，至少还有70只猎豹被殖民地政府为奖励而被杀害。正是这样的威望和猎豹的稀有性使得在20世纪早期，大约有200只猎豹作为替代品从非洲进口。通过对历史标本进行排序，我们可以观察到这段历史的两个阶段。首先，我们从基因上确认印度猎豹（Ind1）可以追溯到19世纪早期的中央邦。其次，我们确定了一只猎豹可能是这200只进口猎豹之一，保存在迈索尔自然历史博物馆（Ind2）。有趣的是，这个标本显示了mtDNA与南非猎豹的关系。印度猎豹历史的主要权威机构Divyabhanushinh引用了支持从东非进口猎豹的消息来源。因此，我们的标本与东南非洲（图1）的迁徙可能令人惊讶，并可能表明南部非洲是非洲猎豹进口到印度的另一个历史来源。目前还不清楚这只特殊的猎豹是用于比赛还是带到其他地方。利用博物馆标本来研究灭绝物种和种群的遗传学，或者实际上超越现存物种种群规模或地理范围的最新变化，是一种强大且日益重要的分子方法。较大的mtDNA编码区片段（图2）在东北非洲猎豹和包括东南非洲和印度猎豹在内的进化枝之间，分别为13.89 万年（100–205.6 ky），而东南非洲和印度猎豹之间的mtDNA分裂日期为7.2万年（50–108.3 ky）。这些差异日期很重要，有两个原因。首先，他们推倒了非洲猎豹亚种之间的线粒体关系。其次，他们认为亚洲和南非猎豹之间的线粒体DNA分裂程度要比目前预期的要高。我们报告的分化日期表明，东北非洲（A.j.soemmeringii）和东南非洲（A.j.jubatus）猎豹的线粒体祖先约为13.89万年（100–205.6 ky），而之前的估计值为6.65 万年（32.3–244 ky）和4.9 千年，我们更深的分歧日期大大早于东非（A.j.raineyi）和东南非（A.j.jubatus）种群根据基因组数据（2.4 万年）进行分离的时间，与所报告的13.1 万年种群扩张更为一致。而根据Dobrynin et al（Ne=1425007），在贝叶斯框架下结合较大的小线粒体DNA片段数据集的亚种差异估计也支持了a.j.jubatus和a.j.soemmeringii之间的古代分裂14.33 万年的观点（95%HPD 75.1–217.2 ky）。A.j.jubatus和A.j.raineyi之间的e分裂通过结合编码和短mtDNA片段数据集的BEAST分析推断为85.8 万年（95%HPD 20.9–160.4 ky），通常大于基因组日期，但重叠。线粒体和基因组数据之间的差异强调了最终包括猎豹每个亚种的全基因组序列对于未来系统地理重建的重要性。尽管如此，我们的研究结果明显反驳了非洲东南部和东北部非洲猎豹最近的分歧。Charruau报告说，亚洲猎豹和东南非洲猎豹之间的线粒体DNA分裂为4.19 万年（20.3–153.8 ky），基于此处分析的一个显著较短的mtDNA片段。日期是使用根据所观察到的猎豹和美洲狮mtDNA之间的遗传距离估计的替代率来确定的，根据Johnson报告的4.92 百万年（95%可信区间=3.86–6.92）美洲狮-猎豹分裂日期进行校准。是我们在系统进化树中应用于美洲虎分裂的同一校准日期；尽管我们能够通过在我们的分析中包括美洲虎进化分支，纳入更长的mtDNA序列和更准确的美洲狮分支群表示。而Charruau报道的亚洲猎豹和东南非洲猎豹的mtDNA分裂。与我们的估计相比，这两个日期的置信区间几乎重叠了。相比之下，O'Brien估计亚洲和各种非洲猎豹线粒体DNA的差异为4383-6576年。最近的数据是基于对A.j.jubatus和A.j.raineyi发散的线粒体DNA分子钟的校准，根据微卫星多样性在拟议的祖先瓶颈中恢复的速率估计为4.2–4.5千年。然而，微卫星表现出极端的突变率变异，因此在没有关于个体微卫星标记突变率的详细信息的情况下，精确的发散日期估计具有挑战性。建议的校准日期4.2–4.5 kya与与A .jubatus和A. j明显不一致。此外，该校准所暗示的快速线粒体DNA突变率表明美洲狮-猎豹的线粒体DNA分裂更为近期-根据建议的纳米比亚（a.j.jubatus）和索马里（a.j.soemmeringii）4877年的分裂日期重新校准我们的进化树，例如，这将导致推断美洲狮-猎豹mtDNA分裂为17.08万年（比Johnson et al.13应用的>3.8my的化石校准更近）。我们的分析不支持将最近的猎豹多样性日期和古代美洲狮-猎豹分化合并在一起所需的相当大的谱系突变率异质性，在这些时间范围内，编码区域不太可能产生诸如突变饱和之类的影响。因此，不支持近千年来在猎豹亚种之间最近的mtDNA起源。

我们提出了另一种假设。Charruau研究了来自伊朗和非洲猎豹的微卫星数据，并根据突变率和建模方法估计了伊朗A.j.Venticus和A.j.jubatus之间最可能的种群分化日期在0.47至6.74 万年之间。考虑到Dobrynin et al使用全基因组数据估计的种群模型，这一时期正好是非洲猎豹祖先相对非常大的有效种群规模（Ne）的时代（12Kya之前，Ne范围为37700至142200）。如果亚洲猎豹从非洲种群中分离出来的>1.2万年，那么，在共同祖先庞大的种群规模的背景下，它们的线粒体DNA预计将在一个相当古老的日期融合。即使考虑到线粒体DNA作为单亲单倍体位点的预期较小的数量，我们古老的线粒体DNA分化日期与Charruau提出的种群分化日期和Dobrynin推断的大祖先种群规模一致。最近的瓶颈导致我们的样本在5万年之前很少出现未回收的线粒体谱系（图S2），这使得估计祖先种群规模和根据mtDNA数据重建亚种分裂日期变得复杂。然而，我们的分析结合了大量短的线粒体DNA片段，得出了a.j.venticus和a.j.jubatus物种的分裂日期为10.3万年（95%hpd45-173.1ky），这与微卫星估计值重叠。我们的研究结果表明，与之前报道的相比，猎豹的线粒体分化日期更为古老，而且猎豹的深层结构也更为复杂。有趣的是，我们认为亚洲猎豹与非洲东南部（而不是非洲东北部）之间的线粒体联系更为密切（图2A）。事实上，在BEAST分析中记录了北非、亚洲和东南非/东非分支之间的快速分支事件序列，在最大可信度树（图2B）中，可追溯到11.6万年（95%HPD 59.5 ky-174.6 ky）和10.16万年（95%HPD 52.1-160.1 ky）之间，这可能与单一的地理辐射有关，可能与晚更新世的气候和生态变化有关。虽然基因组数据支持晚更新世早期种群的增长，但A.j.jubatus和A.j.raineyi的多样性是最近的，这表明，猎豹亚种间的隔离不可能像线粒体数据所显示的那样完整和早，并且有可能支持日期接近可信范围的下限。我们注意到，在这项分析中，可用于大多数样本的mtDNA序列的长度极为有限，微卫星倾向于将东南非洲和东北非洲种群与亚洲猎豹联系在一起。需要进一步的工作来确定这个信号是否稳定，考虑到最近猎豹种群的瓶颈，在种群统计学上是否有意义，以及是否与常染色体一致数据。依据结合大量历史序列数据和多种建模方法，我们的研究有助于解决猎豹的进化史，并对当前有关保护和印度猎豹重新引入印度的争论有一定的启示。综上所述，我们的研究结果表明，亚洲猎豹的分化和局部适应的历史比一些最近的估计以及东非和东南非洲猎豹分裂的1.2-2.4万年时间框架要古老得多。这一数据与鉴别不同猎豹亚种的多重瓶颈一致，可能之前的辐射已经从现代东北非洲猎豹的祖先中分化出来。它也支持亚洲猎豹的大量隔离。线粒体单倍型群的远古差异、其在群内的高频率以及来自非洲（100个样本）和亚洲（19个样本）的猎豹在我们的数据集（表S1）中的良好代表性意味着大量基因将有望在单倍型分布中留下明确的信号。然而，在所分析的数据集中，来自非洲的100个样本中，只有一个显示了亚洲单倍型群（1850年来自埃及），所有带有非洲单倍型组的亚洲样本都可能是或已知的近期易位。线粒体DNA数据所暗示的基因缺失与根据常染色体微卫星数据报告的亚洲和非洲种群的FST更大一致。虽然我们对分歧和孤立的解释是基于单一基因的历史，母系遗传的线粒体DNA，可能会使亚种的年代测定复杂化，我们认为我们的研究结果有力地支持了亚洲猎豹的遗传独特性，以及考虑到它们的极端稀有性，保护野生动物的重要性。

本文是一篇关于不同印度豹亚种遗传差异的报告，而不是一篇关于印度豹重新引入印度的潜在可能性的论文。然而，不管是对是错，考虑到基因研究在指导这场辩论中的作用，一些评论和参考现有文献是恰当的。有两个基本的问题-是否应该重新引入（如果确定了合适的地点，则重新引种）以及如果重新引种，哪个亚种最合适。就后者而言，人们一再指出，虽然伊朗和印度猎豹的遗传关系最为密切，但亚洲猎豹的数量在伊朗受到严重破坏，不足以维持重新引进的猎豹。此外，非洲猎豹亚种和亚洲猎豹之间的遗传差异水平可能不是特别大，从而在遗传上影响非洲猎豹在印度生存的能力。令人欣慰的是，基因模型表明非洲猎豹的严重种群瓶颈已有几千年的历史，这表明低多样性并没有阻止非洲猎豹在这段时期内在广阔、生态多变的地区生存。基因研究，包括我们自己的研究，不排除以基因为理由重新引入。如前所述，在非洲亚种之间的任何选择都需要考虑到生态学和行为的相似性。是否应该重新引入的问题是复杂的，超出了这项工作的范围。经验丰富的遗传学家强烈支持重新引进，已经讨论了合适的地点，而且猎豹亚种之间的总体差异不被认为太大，不排除重新引进。然而，仍有12个担忧。虽然我们看不到任何基因原因排除了重新引进，但考虑到当地环境和生态、动物行为、人为压力、成功的可能性以及对其他潜在濒危物种可能造成的影响，这是当然的重要的。在结论，通过对几个历史和现代猎豹样本的线粒体DNA序列进行测序，我们已经能够重新了解猎豹亚种分化的母体图像。我们的研究结果表明，与之前报道的相比，更古老的分裂日期，因此强调了在亚种规模上保护猎豹的重要性。